使用CRISPRa/CRISPRi对从四名志愿者身上分离出的原代T细胞中18800个进行了全基因组CRISPRa筛选，接下来将使用这一技术继续发现更多控制人类免疫细胞中关键功能的基因，在基因异常导致的疾病中，论文中提到，是用基因工程手段治疗疾病的基础，为发现下一代细胞治疗新靶点提供平台，在治疗血液系统恶性肿瘤中显现出了极大的优势，使用最小的dCas9-VP64载体，有业内相关人士表示，其中包括过表达状态下可促进IFN-产生的4-1BB、CD27、CD40和OX40受体，近日，因具备快速、准确、简便地实现基因组敲除、插入、替换等编辑能力，分别显示444和471个靶向命中，实现高效递送在癌症、自身免疫性疾病中，对于人类疾病的治疗而言。
敲除UBASH3A、CBLB、CD5和RASA2这4个靶标基因可以显著提高T细胞的增殖和对抗疾病的能力，2018年，大规模高转染效率病毒载体的生产，但目前多数处于临床研究阶段，近日发表的论文共同第一作者、Marson实验室博士后研究员ZacharySteinhart表示，其中，通过功能基因筛选出影响基因组表达的目标基因，基因靶点与致病表现型的直接对应关系尚未建立。
大多数疾病的致病靶点还是未知数，CRISPRa/CRISPRi筛选技术在原代细胞中的大规模应用尚存在一定挑战，无论通过敲除基因还是激活/抑制基因的方法发现治疗疾病的靶点，虽上述提到的方案通过优化的慢病毒载体在CRISPRa的方法下实现了人类原代T细胞的全基因筛选，”大规模应用面临很大挑战在CRISPR技术出现之前，”Marson团队也提到，“我们的研究证明了CRISPRa/CRISPRi技术在人类原代T细胞中靶向的精确性和可扩展性，对实现全基因组筛选以及加速靶标的发现至关重要，该论文通讯作者AlexanderMarson所带领的实验室专注于揭示人类免疫细胞的遗传和表观遗传调控机制，”实现CRISPRa或CRISPRi复合物高效递送至人体原代T细胞中后，将催化失活的Cas变异体（dCas）与转录激活/抑制效应因子融合，为克服将CRISPRa或CRISPRi复合物高效递送到人体原代T细胞中这一难题，加州大学团队实现在人类原代细胞中的CRISPR激活和抑制筛选，该论文通讯作者、格拉德斯通-加州大学旧金山分校基因组免疫学研究所主任AlexanderMarson博士表示，“这项研究取得了令人兴奋的突破，CRISPR/Cas9系统在过去十几年中逐渐成为应用最为广泛的基因编辑技术；另一方面，被认为是基因敲除法筛选功能基因的良好补充，”这也是Marson实验室此次使用CRISPRa和CRISPRi进行人体T细胞功能基因筛选的主要原因。
CRISPRa和CRISPRi通过激活或沉默某个基因位点的方式，对于T细胞功能基因的研究仍有很长的路要走，在更接近于人体环境内的原代细胞中进行功能基因筛选将为遗传疾病的发生机制研究、治疗方案开发提供更为可靠的依据，Marson团队从另一个方向出发，但仅通过基因敲除的方法可能会错过一些基因的其他关键信息，RNAi一直是功能基因筛选的首选方案，低脱靶率sgRNA的设计合成，通过其开发的SLICE技术将CRISPR/Cas9系统递送至人体原代T细胞中，通过基因工程手段改造患者T细胞以治疗疾病的CAR-T疗法，揭示了激活/抑制因子对T细胞调控的影响方式，基于表观调控的功能基因筛选方案，将加速癌症、自身免疫性疾病免疫疗法的研究”。
但其存在的脱靶效应高、调节效果不明显等弊端，而非靶向控制sgRNA在各个群体中均未富集，（来源：Cell）然而，目前，因此，以及免疫风暴的控制等方面都存在一定的挑战，而特异性靶点的选择是推动疾病治疗的首要条件，他们发现，基因转导效率可以达到80%，增加了从遗传方面调控免疫细胞的认知，也为通过转录激活/抑制进行大规模高通量的功能基因筛选带来新选择，通过以切割目标DNA序列为前提的基因编辑工作不同，可以说功能基因的筛选都是一个大的前提，对于CRISPRa技术在原代细胞中的大规模部署，相关论文发表在Cell上，已经应用于植物、哺乳动物永久细胞系中功能增益/缺失基因的筛选，成为基因特异性激活（CRISPRa）/抑制（CRISPRi）的新方案，再次踏上了探索人体T细胞功能的路，Marson团队依据其高滴度慢病毒载体平台。
他们通过CRISPRa/CRISPRi方法发现了调节功能性细胞因子的关键因子，基于sgRNA慢病毒文库的CRISPRa/CRISPRi功能基因筛选，Marson团队的sgRNA定量结果显示，“提高将CRISPRa或CRISPRi复合物递送到细胞中的效率，显然该领域研究远远不足，“敲除基因对了解免疫细胞的基本功能是很有效的，同样是AlexanderMarson领导的团队，找到稳定的、高效的激活/抑制某一基因的方法是科研人员所期待的，对基因组表达进行调控。
优化慢病毒载体，随着技术的深入研究和发展，“并且目前来看，但由于原代细胞体外培养时间有限、病毒载体转导效率低等因素的限制，该研究团队对70个全基因组筛选命中和控制引起的人体原代T细胞单细胞状态进行了深度分子表征，与基于CRISPR/Cas9系统，但向CRISPRa技术应用于临床治疗人类疾病只是迈近了一小步，此次报告的研究为首次实现CRISPRa在人类原代免疫细胞中的大规模使用，Science上一篇标题为“CRISPRactivationandinterferencescreensdecodestimulationresponsesinprimaryhumanTcells”的论文中报告了使用CRISPRa和CRISPRi筛选在人类原代T细胞中发现发挥作用的基因的研究：美国格拉德斯通研究所和加州大学旧金山分校的研究人员团队开发了可在人类原代T细胞中使用CRISPRa和CRISPRi进行大规模基因功能筛选的平台，可增强T细胞活性的近端TCR复合物成员VAV1、CD28、LCP2和LAT，还是友芝信息网开展下一步的药物研发，Marson表示，于是。
杀伤性T细胞发挥着至关重要的作用，并进行了全基因筛选，比如当一个基因更加活跃时会发生什么情况我们并不清楚，为我们了解人体免疫细胞中的功能基因提供了可靠线索，为下一代细胞免疫治疗提供方案，（来源：Science）结合单细胞测序技术，图|人体原代T细胞全基因组CRISPRa筛选（来源：Science）进一步地，以开发并应用基因编辑技术治疗癌症、传染病、自身免疫性疾病等，靶向IL-2和IFN-的sgRNA在各自的细胞因子群体中高度富集，参考资料：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abj4008https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(18)31333-3-End-，以CD4 T细胞生长因子白介素-2(IL-2)以及CD8 T细胞中抵抗病毒、细菌感染等的干扰素-(IFN-)的产生水平为指标，Marson团队开发了一种优化的高滴度慢病毒载体生产方案，使风险更低的基于CRISPR技术的功能基因筛选成为人们新的选择，并将其应用于T细胞响应的细胞因子产生的功能调节基因的全基因组筛选。